AAV载体构建莫忧愁金唯智HiFi技能为你解忧

一

布景介绍

基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺点或基因表达反常引起的疾病。腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的一种明星载体，关于人类霸占癌症或更多的严重疾病有着巨大的潜力。

为发作重组腺相关病毒(rAAV)，哺乳动物或昆虫细胞一般需求共转染两个或许三个质粒——其间一个或两个质粒供给AAV包装仿制元件和腺病毒辅佐元件，别的一个质粒(AAV质粒)包含两头带有ITR序列的意图基因表达框。

图1：AAV病毒基因组结构（图片来自：参考资料[1]）

AAV质粒中ITR区域的完好性对rAAV的发作至关重要。缺失骤变的ITRs会下降完好AAV病毒的产值，添加非意图DNA包装的发作1。但是，在运用大肠杆菌进行质粒扩增过程中，AAV质粒的ITR区域常常发作骤变。研讨标明，ITR序列的不同区段（A-A’ region，B-B ’region， C-C’ region以及D region）缺失，都会对rAAV的发作形成影响。对AAV质粒的ITR序列进行精确的剖析将会对rAAV的质控具有重要的含义。

图2：AAV2的ITR序列的示意图。ITR由两个臂回文(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。D序列在AAV基因组的每一端只呈现一次。

二

面对应战

现在，rAAV质粒主要在细菌中扩增。但是，由于细菌中同源重组体系，ITRs常常发作重排。细菌繁衍后，rAAV质粒中最常见的骤变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失(图2)。这种缺失使T型ITR发夹的茎更长，比野生型ITR愈加安稳。

图3：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺失的示意图。野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹结构，而缺失骤变的ITR是一个103bp的发夹结构，其茎部更长。

针对ITR易缺失的特性，科学家们一向尽力寻觅能使rAAV质粒的ITR在细菌中坚持安稳扩增的办法，现在市场上运用较多的办法是经过运用特别的大肠杆菌细胞来坚持其安稳。市场上现在反应比较好的，有来源于I公司的S13和S14，它被规划为专门克隆不安稳基因（如包含有正向重复的慢病毒DNA），还有许多客户依据在多年AAV方面研讨的经历，也会运用B83 (来源于A公司)、D10(来源于I公司)和S2(来源于A公司)等大肠杆菌细胞。

GENEWIZ经过专利的ITR测序办法（该办法可以测通野生型ITR序列以及更有应战性的缺失骤变的ITR序列，能协助定性评价ITR区域乃至是缺失骤变ITR区域的完好性）和很多的rAAV质粒构建经历，发现这些细胞的效能也是有限的，并不能遍及安稳不同的rAAV质粒（表1）。

三

解决计划

为此，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、过错ITR的修正和rAAV质粒很多制备的办法——Hi-Fi技能，该办法的中心点不仅仅是拟定了更简略、灵敏和快速的克隆计划，而更重要的是发明晰一种特别的大肠杆菌细胞及其配套运用的AAV安稳剂，较现有的办法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中坚持安稳，不易再发作缺失（表1）。

表1：5个随机AAV构建后ITR的正确性

根据感受态细胞的比照数据，咱们进一步探究了Hi-Fi技能流程在转化挑选正确克隆过程中的才能。由于ITR自身的不安稳性，在质粒构建的过程中，会有发作骤变的可能性。

原始质粒：

第一次转化成果：

现在金唯智根据Hi-Fi技能可以供给rAAV的质粒构建，ITR区域的修正和rAAV质粒很多制备以及AAV病毒包装等相关服务。

四

技能流程

01

AAV载体构建

02

ITR区域修正

五

金唯智rAAV的质粒构建具有以下特色

先进的组成技能：可以组成高难度重复序列，高GC含量的困难序列以及含有发夹结构的ITR区域。

质量牢靠：酶切和测序两层检测，金唯智自主研制的ITR测序技能可以测通ITR区域，保证序列100%正确。

免费的表达体系优化：可以精确的经过表达体系对意图基因进行密码子优化。

周期短：rAAV-ITR载体构建最快仅需8-12天；

完善的服务流程：可以供给从基因组成，载体构建到病毒包装的一站式服务。

图4 AAV2载体

六

交给规范

AAV-ITR构建、修正，满意：

ITR区域测序并保证正确；

2-5 ug；

AAV-ITR大抽，满意：

ITR区域测序并保证正确；

晋级服务：

≥90%超螺旋，内毒素≤10EU/mg；

ug-g等级的发货量；

0.22um过滤除菌；

注：由于涉及到技能秘要，相应的菌株暂时不会发货给客户

七

事例共享

项目类型：Hi-Fi 技能构建 rAAV 载体

意图基因以及ITR区域组成之后，构建AAV载体之后，再利用Smal酶进行酶切后，验证条带巨细。

图5: 酶切图，L1: undigested；L2: digested with Smal and BsrGI；L3: ladder 5000

条带巨细正确后，再利用sanger测序技能，测定意图基因和ITR区域序列：

图6：ITR区域测序图

上图可以精确的看出，Sanger测序验证了rAAV左右两边的ITR区域序列正确。然后保证rAAV载体构建正确。

项目类型：Hi-Fi技能修正ITR序列

AAV原始质粒ITR缺失骤变，惯例PCR扩增很难直接完结序列修正，金唯智经过特定修正计划及Hi-Fi技能流程，成功交给多例修正质粒。

End

参考资料：

[1] Kotterman M A, Schaffer D V. Engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(7): 445-451.

[2] Savy A. et al.,Impact of inverted terminal repeat integrity on rAAV8 production using thebaculovirus/Sf9 cells system. Hum. Gene Ther. Methods. 2017:28(5):277-289.